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熒光分光光度計由光源氙弧燈發出的光通過切光器使其變成斷續之光以及激發光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質的激發光，被測的熒光物質在激發光照射下所發出的熒光，經過單色器變成單色熒光后照射于測樣品用的光電倍增管上，由其所發生的光電流經過放大器放大輸至記錄儀，激發光單色器和熒光單色器的光柵均由電動機帶動的凸輪所控制，當測繪熒光發射光譜時，將激發光單色器的光柵，固定在最適當的激發光波長處，而讓熒光單色器凸輪轉動，將各波長的熒光強度訊號輸出至記錄儀上，所記錄的光譜即發射光譜（emission spectrum），簡稱熒光光譜。
熒光分光光度計，是當測繪熒光激發光譜時，將熒光單色器的光柵固定在最適當的熒光波長處，只讓激發光單色口的凸輪轉動，將各波長的激發光的強度訊號輸出至記錄儀，所記錄的光譜即激發光譜（emission spectrum）。
當用熒光分光光度計進行樣品溶液的定量分析時，將激發光單色器固定在所選擇的激發光波長處，將熒光單色器調節至所選擇的熒光波長處，由記錄儀得出的信號是樣品溶液的熒光強度。
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